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生物表面活性劑產生菌的篩選及對PAHs污染環境的修復效果研究(三)

來源:農業環境科學學報 瀏覽 102 次 發布時間:2025-07-31

2結果與討論


2.1生物表面活性劑產生菌的篩選和鑒定


經過血平板初篩得到25株菌株,表1是表面張力儀復篩結果??梢园l現147號細菌發酵液的張力值明顯低于其他菌株,選擇147細菌作為目標菌株。


觀察菌株培養特征及形態特征,可見菌體細長且長短不一,菌落較小,為扁平、濕潤的菌落。部分生理生化指標如表2。經16S rDNA測試并與GenBank中已登錄的核苷酸序列號進行同源性比較,發現菌株147與Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性為99%,采用MEGA 5.10軟件NJ方法構建147的16S rDNA系統發育樹見圖1。結合生理生化特征結果,將菌株147鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),該菌株GenBank登錄號為KU921686。

表1細菌復篩結果

表2 147菌株的生理生化特性


2.2147細菌產生表面活性劑的物質結構鑒定


通過薄層色譜分析顯示,苯酚-硫酸試劑有棕色斑點,加入茚三酮顯色劑則無明顯變化。這說明該菌株主要產糖脂類生物表面活性劑,不產生或者產生少量的脂肽類物質。


將菌株147產物提純,紅外光譜儀(FT-IR)分析物質結構,結果如圖2。該物質在3701.72cm-1處有吸收峰,表明分子中有羥基存在;2 858.77~2 927.56 cm-1處的吸收峰表明存在糖類C-H的伸縮振動,1400~1200 cm-1處是C-H變角振動,1 734.39 cm-1處是C=O的雙鍵振動,而1 070.04 cm-1處為C-O-C鍵伸縮振動,因此該物質中有一個五元環狀內酯和糖苷鍵存在。由此進一步證明該生物表面活性劑含糖脂類物質。


發酵產物臨界膠束濃度是指分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度。臨界膠束濃度(Critical micelle0.005 concentration,CMC)可以作為表面活性劑表面活性的一種度量,CMC越小,改變表/界面性質,起到增溶、乳化等所需的濃度就越低。從圖3可以看出:糖脂在0~300 mg·L-1時,表面張力值隨著糖脂濃度的升高而降低,且在300 mg·L-1時達到最小值;在300~500 mg·L-1時,表面張力值變化不大。可得發酵粗提產物的CMC為300 mg·L-1,明顯低于普通化學表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)的2200 mg·L-1,能在較低濃度下使用,因而在醫藥、食品、化工等行業具有廣闊應用前景。

圖1 147菌株16S rDNA基因序列系統發育樹

圖2 147菌株產的生物表面活性劑紅外光譜圖

圖3不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力


2.3147細菌發酵條件優化


2.3.1碳源的影響


碳源對細菌的生長與發酵產物量有重要影響。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可在多種類型碳源下產生生物表面活性劑,包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知,以花生油為碳源,細菌發酵液的降低值為39.12 mN·m-1,明顯高于其他碳源類型;乳化值為34.17%,稍高于其他碳源,此時細菌生物量最大,糖脂含量最高,為0.30 g·L-1。雖然花生油作為碳源,能夠促進菌株產生更多生物表面活性劑,但如果用于實際生產,成本相對較高,近年來一些研究者嘗試使用成本較低的工業副產物如糖蜜、廢潤滑油等作為碳源,發現也具有很好的促進微生物產生生物表面活性劑的作用。因此,后期會考慮選擇用一些低成本碳源進行發酵。


2.3.2氮源的影響


細胞表面的物質合成需要氮源,氮源的種類會對細菌細胞的生長和發酵產物的產量產生很大影響。由表4可以看出,不同氮源對細菌發酵過程中表面張力降低值的影響較小,可能與發酵液中的生物表面活性劑含量已經達臨界膠束濃度(CMC)有關。當氮源為硫酸銨時發酵液表面張力降低值最大,同時乳化性、細菌干重、糖脂含量均達到最大值。這與錢曉勇等研究結果一致,硫酸銨是促進生物表面活性劑生成的較好氮源。

表3碳源對147細菌生長以及生物表面活性劑產量的影響

表4氮源對147細菌生長以及生物表面活性劑產量的影響


2.3.3碳氮比的影響


由表5可以發現當碳氮比在5以上時,表面張力降低值與乳化性變化不大,而細菌干重與生物表面活性劑含量卻明顯不同,說明當碳氮比大于5時,該菌株生物表面活性劑產量已經超過臨界膠束濃度。細菌干重在碳氮比為25時最大,為2.58±0.09 g·L-1,同時生物表面活性劑含量也達到最大,為1.74±0.01 g·L-1。這與Saimmai等研究結果一致,25是147菌株的最適生長碳氮比,此時細菌的生物量達到最高,生物表面活性劑產量也最高。


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